Появление Национального музея в Чешской Республике, как и в других европейских странах, связано с накоплением коллекций, состоящих из подарков больших частных коллекций, в основном собраний, которые находились во владении чешских аристократов.
Но это стало лишь толчком для возникновения музея. Целая группа просвещенных дворян задолго до этого занималась подготовкой основания музея. Они создали Содружество Патриотического музея в Чехии, которое 15 апреля 1818 года подписало провозглашение об основании музея, а первым председателем Содружества стал граф Кашпар Мария Штернберг (1761-1838) — всемирно известный деятель в области палеонтологии.
Еще одно имя тесно связано с историей Национального музея. Это имя историка Франтишка Палацкого (1798-1876). Его организаторский талант и трудолюбие позволили ему быстро завоевать ведущую роль и уважение среди представителей чешского национального движения. Благодаря его усилиям укрепилось положение исторических дисциплин в музее. Большое значение для музея и научной жизни Чехии сыграло основание первых научных журналов, Журнала Национального музея (1827) и «Матицы чешской» (1832), в которых печатались научные и литературные работы. Инициатором создания этих журналов был Франтишек Палацкий.
Вслед за периодом Штернберга и Палацкого в развитии музея настало время, для которого характерны углубление и профессионализация деятельности.
Во второй половине 19 века в Национальном музее начинают возникать научные работы, которые имели основополагающее значение для развития множества научных дисциплин. Это произошло еще и потому, что в музейную коллекцию были включены самые значительные чешские частные коллекции. К их числу принадлежат: коллекция чешских минералов Линдецкера, гербарий Штернберга, а также его палеонтологическая и геологическая коллекции. В общей сложности 145 тысяч предметов. Естественно, что быстро разрастающаяся коллекция музея привела к идее постройки специального здания, где бы могли постоянно находиться экспонаты музея.
Первым, кто задумался об этом, был еще в свое время Палацкий. В 1840 году он предложил построить здание музея в рамках центра науки и культуры, но по разным причинам строительство не осуществилось, и музею пришлось несколько раз переселяться. Только в 1883 году был объявлен конкурс на проект здания Национального музея. Победителем стал Йозеф Шульц.
Торжественное открытие Музея Королевства Чешского состоялось 18 мая 1891 года.